Akademik Veri Yönetim Sistemi
Şen A., Ayaz Guner Ş. A., Gungor B., Erturk Zararsiz G., Guner H., Yousef M.
TÜBİTAK Projesi, 2024 - 2027
Aksonlardaki miyelin yıkımıyla karakterize merkezi sinir sistemi hastalığı olan multipl sklerozun (MS) etiyolojisi belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, karmaşık genetik unsurların ve potansiyel çevresel etkilerin bir kombinasyonunun bu durumun gelişimine toplu olarak katkıda bulunduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. Son araştırmalar, uzun kodlamayan RNA'ların (ukmRNA'lar) kanser ve diğer karmaşık hastalıkların gelişiminde önemli etkileri olduğunu göstermiştir. Üstelik ukmRNA homeostazının bozulması, çeşitli özbağışıklık hastalıkların başlangıcında ve ilerlemesinde çok önemli bir faktör olduğu bilinmektedir. MS bireylerde ukmRNA'ların düzensizliği rapor edilmiş olmasına rağmen, MS bağlamında kodlamayan RNA'ların (kmRNA) spesifik fonksiyonel rolleri ve düzenleyici mekanizmaları tam bilinmemektedir. Mevcut araştırmalarla birlikte, laboratuvarımızda elde edilen veriler ve kontrol denekleriyle karşılaştırıldığında multipl sklerozlu (MS) kişilerin beyin dokularından elde edilen transkriptom verileriyle ilgili analizlerimizden elde ettiğimiz sonuçlar, MS patolojisi bağlamında ukmRNA XIST (X-etkin olmayan spesifik transkript) düzensizliğini teyit etmektedir. Bu bilgiler, XIST'in bilinen X kromozomu inaktivasyon sürecinden farklı olarak MS gelişiminde miRNA-mRNA ekseninin düzenleyicisi ya da farklı bir mekanizma ile özgün bir rol üstlendiğini göstermektedir. Sonuç olarak, XIST'in kalıtsal yatkınlığa dahil olabileceği, böylece MS tedavisi için yeni terapötik hedefler sunabileceği ve teşhis ve tedavi alanında önemli biyobelirteçleri ortaya çıkarabileceği aşikardır.
Bu kapsamda, XIST'in MS patofizyolojisini aydınlatmak ve nörogenez sürecindeki (kök hücrelerin nöronlara dönüşümü) işlevini tanımlamak için vasküler beyin organoidleri (VBO) kullanılarak araştırmalar yapılacaktır. XIST'in ifadesi, H1 embriyonik kök hücrelerden türetilecek VBO oluşturma aşamasına ilerlemeden önce hem artırılması hem de baskılanmasını kapsayan CRISPR/dCas9 teknolojisi kullanılarak değiştirilecektir. Daha sonra, aşırı ekspresyona, baskılamaya ve kontrol koşullara (hedefleme olmayan SgRNA) tabi tutulan H1 hücrelerinden VBO'lar elde edilecektir. In vitro VBO'larda miyelinasyonu tetiklemek için olgunluk aşamasında küçük bileşiklerin uygulanması kullanılacaktır. Ek olarak nöroenflamasyona benzer bir tepki ortaya çıkarmak için lipopolisakkarit (LPS) de uygulanacaktır. Yukarıda belirtilen prosedürler şu anda laboratuvarımızda optimize edildi ve rutin olarak uygulanmaktadır. Bu çalışma, 3 boyutlu hücre kültürü modelinin uygulanmasıyla XIST'in MS patogenezindeki rolünü araştırmayı amaçlamaktadır. Ayrıca çalışma, XIST'in beyin nörojenezindeki, özellikle de kök hücrelerin nöronlara dönüşümü süreçlerindeki rolünü de araştıracaktır. VBO’larda morfolojik farklılıkları incelemek için hem farklılaşmamış organoidler (embriyonik cisimcikler) hem de olgun VBO’lar üzerinde immünohistokimyasal boyama gerçekleştirilecektir. Sonraki aşamada mRNA profillerini ve kmRNA profillerini belirlemek için RNAseq transkriptomlarının analizi gerçekleştirilecek, XIST'in gen ifadeleri üzerindeki etkisi beyin organoidlerinde incelenecektir. mRNA ve kmRNA'nın profilinin çıkarılmasına ek olarak, XIST'in düzensizliğinden kaynaklanan değişken protein modellerini tanımlamak için VBO’lar üzerinde proteomik analizler de gerçekleştirilecektir. Ek olarak, daha önce multipl skleroz tanısı alan hastalara dair yayınlanmış transkriptom verileri, grubumuz üyelerince yakın zamanda geliştirilen makine öğrenimi teknikleriyle analiz edilerek, MS’de etkilenen gen ontoloji terimleri, yolaklar ve bunlarla ilişkili mRNA grupları belirlenecektir. Literatür verilerindeki XIST ifade miktarı ile MS hasta ve sağlıklı grubu ayırt eden mRNA’ların ifade miktarları arasındaki korelasyon incelenecektir. Kendi üreteceğimiz transkriptom verilerinde ukmRNA XIST miktarı düşük olan grupla yüksek olan grup karşılaştırmalı analiz edilerek, bu iki grup arasında belirli mRNA’lar ve belirli miRNA’ların ifade miktarları önemli derecede değişiyor mu, değişiyorsa hangi miRNA-mRNA çiftlerinin ifade miktarı önemli derecede değişiyor sorusunun cevabı aranacaktır. İfadeleri transkriptomik ve proteomik analizlerle tanımlanan genlerin ve proteinlerin doğrulanması sırasıyla qPCR ve immünohistokimya yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilecektir. Böylelikle XIST'in multipl skleroz (MS) ve nörogenez etiyolojisindeki düzenleyici fonksiyonunun kapsamlı ve mekanik bir anlayışı açıklığa kavuşturulacaktır. Verilen çerçeve dahilinde proje, mevcut literatürdeki bir araştırma boşluğunu gidermek ve mevcut çelişkili veri havuzuna değerli bir katkı sağlamak gibi ikili bir amaca hizmet edecektir. Ayrıca, multipl skleroz (MS) ve diğer nöroenflamatuvar özbağışıklık bozukluklarda terapötik müdahaleler için potansiyel kmRNA hedeflerinin keşfedilmesine yol açacaktır.